что окрашивается в зеленый цвет при флуоресцентной микроскопии

Флуоресцентная микроскопия

Флуоресцентная микроскопия на сегодня является одним из распространенных методов исследования, в котором используется метод люминесценции (свечения) объектов. Дело в том, что существуют предметы, которые рассмотреть и изучить в обычном свете невозможно из-за того, что они не видны. Благодаря ультрафиолетовому излучению, которое на них попадает, такие вещества начинают светиться и подлежат исследованию с помощью специальной микроскопии. Помимо этого при флуоресцентной микроскопии используют и специальные красители (подобрать их можно с помощью специальных таблиц), так как определенные вещества взаимодействуют строго с определенными красителями, что облегчает процесс их исследования и изучения.

что окрашивается в зеленый цвет при флуоресцентной микроскопии

Метод люминесцентной микроскопии представляет собой физический процесс, где любое вещество органической или неорганической природы способно поглощать фотоны света, излучая при этом свет другой волны. Фотоны света, исходят из веществ, значительно низкой энергии, но имеют большую длину волны. Впервые этот метод был обнаружен еще в 19 веке нашего столетия английскими учеными, но только в начале 20 века ученые научились использовать данное свойство для изучения мелких веществ путем окрашивания их. Изобретение и совершенство флуоресцентного микроскопа настолько велико, что ученым удается проводить исследование объектов, размер которых колеблются от 1 до 10 нм.

Флуоресцентный метод – это явление физическое, при котором происходит поглощение кванта энергии флуорофором (вещество, способно светиться в темном поле). Использование данного метода активно используют не только в медицине, но и в физике и биологии.

Использование флуоресцентного микроскопа основано на том, что объект, подлежащий исследованию, начинает светиться после световозбуждения. Таким светом является электромагнитная волна ультрафиолета. С помощью зеркала, расположенного на штативе, свет попадает вертикально на предмет исследования. Флуоресцентный источник света чаще всего является ртутная или ксеноновая лампа. Свет от источника попадает на предмет излучения и часть лучей поглощается им, а другая часть отражается к человеку вместе с собственным излучением объекта. Для того, чтобы их разделить, перед линзой установлен фильтр, который лучи с короткой длинной волны отсекает.

Применение флуоресцентных микроскопов стало активно использоваться спустя несколько сотен лет после его изобретения. Благодаря совершенству микроскопов, ученые используют их не только в медицинской сфере, но и в биологии, судебной медицине, криминалистике и прочее. Именно с помощью флуоресцентной микроскопии сегодня проводятся исследования различных инфекционных заболеваний проводится исследование клеток крови, костного мозга, а также изучение клеток сетчатки глаза, ведь такие элементы, как палочки и колбочки слишком маленькие (1 нм) и рассмотреть в обычных микроскопах не удается.

Флуоресцентная микроскопия: описание метода

Для того, чтобы разобраться, как работает данный метод, мы вкратце рассказали Вам об основных моментах микроскопа. Сейчас остановимся на самом процессе исследования. Итак, исследуемый образец помещается на предметное стекло микроскопа и освещается светом определенной волны, который поглащается специально обработанным его флуорофором, способный излучать свет более длинной волны, что делает его другим цветом. Для того, чтобы изображение было четким, в таком микроскопе используется один из методов освещения: ксеноновая лампа, лазер, суперконтинуум, светодиодная лампа или ртутная.

Благодаря флуоресцентной микроскопии ученым и исследователям удается получать изображение в увеличенном варианте с помощью использования возбужденных атомов и молекул. Микроскопы, работа которых основана на флуоресцентном методе, образец облучается светом с большой частотой, а изображение – в оптическом спектре. От исследуемого образца отражается излучение, проходит через специальные фильтры, которые способны отсекать свет на высоких частотах, создавая красивую, четкую картинку.

Учитывая то, что не все предметы и объекты, которые подлежат исследованию, проводят свет и отражают его, проводя исследование с помощью флуоресцентного микроскопа, прибегают к использованию специальных люминесцентных красителей, которые носят название флуорохромов. Способность их диффузно или избирательно накапливаться в клетках позволяет проводить многочисленные исследования и наблюдения. Но есть и вещества, которые связываются с химическими веществами и также выделяют свет. В качестве флуорохромов сегодня используют множество органических соединений (производные акрила, хлорофилл, липохромы, хинин, бензпирен, азокрасители), которые являются самыми распространенными и широко используемыми. Окраску препарата проводят прижизненно или после фиксации. Учитывая то, что красители разводят максимально, повреждающее действие вещества на клетку не происходит, поэтому данный метод микроскопии активно используется прижизненно.

что окрашивается в зеленый цвет при флуоресцентной микроскопии

На нашем рынке сегодня представлен широкий выбор флуоресцентных микроскопов, выбрать которые Вы можете самостоятельно или воспользовавшись услугами интернет магазинов.

Преимущество флуоресцентного метода микроскопии

Дело в том, что с помощью данного исследования удается максимально быстро провести оценку состояния клеток водорослей или других растений, не повреждая их структуру. Помимо этого, метод флуоресцентной микроскопии быстрый, точный и удобный. С помощью него санитарные службы проводят экспресс тесты на степень загрязнения вод, определяют токсичность веществ.

Получение изображение с помощью флуоресцентного микроскопа связано с тем, что в оптическую его систему введены два фильтра, пропускающих и преломляющих свет. Первый светофильтр располагается перед конденсором, работа которого направлена на пропускание только тех волн, которые приводят к возбуждению люминесценции, излучающие объектом самостоятельно или те, что образуются от красителей, заранее введенные в препарат. А вот после объектива на микроскопе расположен второй светофильтр, действие которого направлено на пропуск к глазу наблюдателя люминесцентный свет. Освещение исследуемого объекта может быть осуществлено как сверху, так и снизу. При освещении сверху метод исследования носит название микроскопии в отраженном свете.

Учитывая то, что метод флуоресценции на сегодня принято считать одним из самых чувствительных методов, которые позволяют проводить исследования объектов не разрушая их, применение его во многих областях актуально и распространено. Дело в том, что не только в медицине, но и в биологии, физике, криминалистике и прочих науках использование данного метода исследования с каждым годом неуклонно растет. Сегодня Вашему вниманию на рынке представлен широкий выбор микроскопов такого плана, которые отличаются не только фирмой производителем, но и оптикой, разрешающими способностями, видом освещения и прочее.

Источник

Флуоресцентная микроскопия

что окрашивается в зеленый цвет при флуоресцентной микроскопии

Флуоресцентная микроскопия – это оптический метод исследования объектов, где используется явление люминесценции или свечения. В основе лежит физический процесс, при котором вещество поглощает свет с одной длиной волны, и сразу после этого излучает свет уже с другой длиной волны. Соединения или фрагменты структуры, обладающие такими свойствами, называют флуорофорами.

Немного истории

Явление флуоресценции впервые обнаружил Джон Фредерик Уильям Гершель в 1845 году. Он заметил, что сам по себе бесцветный и прозрачный раствор хинина в солнечном свете излучает насыщенный небесно-голубой цвет. Открытие Гершеля заинтересовало британского учёного Джорджа Габриэля Стокса. Он продолжил исследование и обнаружил, что флуоресцентное излучение (эмиссия) объекта имеет бóльшую длину волны, чем свет, который первоначально возбуждает объект. Разница длин волн максимумов в спектрах поглощения и флуоресценции, открытая Стоксом в 1852 году, называется Стоксов сдвиг.

Первые флуоресцентные микроскопы сконструировали Август Кёлер (1904 год), Карл Райхерт и Оскар Хеймштадт (1911 год), а также Карл Цейсс и Генрих Леман (1913 год). Вначале учёные проводили исследования лишь с веществами, обладающими собственной флуоресценцией или аутофлуоресценцией. К таким веществам относится, например, аминокислота триптофан, входящая в состав большинства белков.

что окрашивается в зеленый цвет при флуоресцентной микроскопии

В 1930-х гг. появились первые флуоресцентные метки или зонды для маркировки нефлуоресцирующих объектов. В 1950-х гг. Альберт Кунс и Натан Каплан разработали метод обнаружения антигенов в тканях с использованием антител, меченных флуоресцентными красителями.

Сегодня флуоресцентная микроскопия применяется для решения разных задач, а оборудование и методы сильно превосходят те, с которых всё начиналось. В распоряжении учёных есть микроскопы с высоким разрешением и множество высокоселективных флуоресцентных зондов для маркировки самых разных объектов. (Рекомендуем статью: «Современные методы в генетическом анализе»)

Особенности метода

Большинство компонентов клетки бесцветны и не чётко различимы под обычным микроскопом. С этой проблемой успешно справляется флуоресцентная микроскопия. Нужные для изучения структуры выделяют флуоресцентными метками – соединениями, поглощающими свет заданной длиной волны и после короткой задержки излучающими свет с большей длиной волны, чем поглотили. Например, если поглощается ультрафиолетовый свет, то излучаться будет синий свет или свет с ещё бóльшими значениями длин волн (зелёный, жёлтый, красный). Увеличение длины волны связано с тем, что в процессе поглощения-излучения теряется энергия, поэтому испускаемый фотон имеет меньше энергии, чем поглощённый. Чем ближе свет к красной зоне электромагнитного спектра, тем больше значение длины волны и меньше энергия фотонов.

что окрашивается в зеленый цвет при флуоресцентной микроскопииДля каждого флуорофора характерны свои специфические спектры поглощения и излучения в зависимости от структуры молекулы и её окружения.

Флуоресцентная микроскопия превосходит методы исследования, при которых объекты окрашиваются поглощающими свет веществами. При использовании оптических красителей количество поглощённого света незначительно отличается от фона, поэтому получается трудноразличимое изображение с низким контрастом. А при исследовании с помощью флуоресценции можно увидеть даже отдельные макромолекулы. Флуоресцентная микроскопия позволяет избирательно исследовать отдельные компоненты в сложных биомолекулярных комплексах.

Чтобы увидеть расположение только флуоресцирующих объектов, излучаемый свет отсекают от возбуждающего специальным барьерным фильтром. При этом структуры, меченные флуоресцентными зондами, проявляются на чёрном фоне.

Как устроен флуоресцентный микроскоп?

Флуоресцентный микроскоп – это оптический микроскоп, который использует флуоресценцию вместо или в дополнение к исследованиям в отраженном и поглощённом свете. С его помощью проводят исследования даже очень маленьких объектов размером порядка 5 нм.

что окрашивается в зеленый цвет при флуоресцентной микроскопииОсновные элементы флуоресцентного микроскопа:

За счёт блокировки «лишнего» свечения, в том числе аутофлуоресценции образца и системы, оптические фильтры в флуоресцентном микроскопе дают самый тёмный фон и яркое, контрастное изображение с высоким разрешением.

Задачи флуоресцентной микроскопии

Флуоресцентная микроскопия применяется для изучения свойств органических и неорганических веществ в материаловедении, биологии, медицине, физике.

Основная область применения – клеточная биология, особенно нейробиология. Флуоресцентная микроскопия позволяет чётко увидеть определённые структуры в клетке, получить количественные и качественные характеристики о взаимодействиях внутри клетки, анализировать морфологию, внутриклеточные физиологические изменения.

Разработано множество флуоресцентных зондов для изучения процессов в ядре, митохондриях, эндоплазматическом ретикулуме, синаптических везикулах. Есть зонды, способные связываться с белками или встраиваться в липидные структуры. (Рекомендуем статью: «Современный подход к культивированию микроорганизмов и культур клеток»)

С помощью флуоресцентной микроскопии исследуют инфекционные болезни, клетки крови, костный мозг, изучают фоторецепторы сетчатки глаза.

что окрашивается в зеленый цвет при флуоресцентной микроскопииПреимуществами метода считаются высокая чувствительность, возможность комбинировать флуоресцентные зонды и окрашивать разными цветами отдельные объекты в исследуемом образце, одновременно отслеживать несколько типов макромолекул, проводить мультиплексный анализ. Эти подходы используются для изучения строения, функций клеток, организации клеточных структур, подвижности объектов.

К ограничениям флуоресцентной микроскопии относятся потеря способности к флуоресценции или фотообесцвечивание при накоплении повреждений от электронов, возбуждающихся при флуоресценции, а также фототоксичность для некоторых объектов. Для снижения фототоксичности используют лазерные сканирующие микроскопы с нелинейной оптикой, которые возбуждают флуорофоры длинами волн, близкими к инфракрасному свету. Это значительно снижает токсический эффект и увеличивает время проведения исследования.

В современных флуоресцентных микроскопах изображение объекта получают в цифровом формате. Управление фокусировкой, высотой предметного столика, оптикой, фильтрами, детекторами осуществляют при помощи компьютера. Используются технологии оптоэлектроники, при помощи которых можно управлять субклеточными структурами специальными оптическими пинцетами.

что окрашивается в зеленый цвет при флуоресцентной микроскопииОдним из современных вариантов флуоресцентной микроскопии является конфокальная микроскопия с применением лазерных источников света. Её особенность в использовании точечной диафрагмы, которая размещается в плоскости изображения и ограничивает поток фонового рассеянного света. Лазерная конфокальная микроскопия даёт трёхмерное изображение объекта, позволяет изучать структуру, в динамике исследовать развитие клеток и тканей, в том числе живых.

Несмотря на то, что основы для развития современной флуоресцентной микроскопии были заложены более 100 лет назад, интерес к этому быстрому, точному и относительно простому методу сохраняется до сих пор. Он находит широкое применение в разных областях науки и лабораторной диагностики. На протяжении последнего десятилетия ежегодно по исследованию объектов и процессов методом флуоресцентной микроскопии публикуется от 5000 до 10000 научных статей.

Источник

Принцип работы флуоресцентного микроскопа

Флуоресцентный микроскоп стал важнейшим инструментом в современной биологии и медицине. Он позволяет детально исследовать динамические процессы на уровне молекулярных и клеточных структур, предоставляя специалистам высокоточные изображения изучаемых объектов.

Основные понятия

Флуоресценция относится к процессам люминесценции, при которых чувствительные молекулы испускают свет, находясь в электронно-возбужденных состояниях, создаваемых физическими или химическими механизмами.

В данном случае свечение становится следствием воздействия излучений ультрафиолетового или видимого спектра.

Флуоресцирующие молекулы называют флуорофорами. Поглощение и испускание фотонов веществом происходят почти одновременно. При более длительном временном интервале между этими процессами целесообразно говорить о явлении фосфоресценции.

Сфера использования

Высокочувствительные флуоресцентные микроскопы широко используются в медико-биологических областях. Они позволяют наблюдать за локализацией молекул и микроорганизмов, визуализировать и исследовать их специфические особенности.

При этом флуоресценция не оказывает мощного угнетающего действия на клетки, что облегчает мониторинг их внутренних динамических процессов.

Подобные микроскопы также применяются в материаловедении. Они помогают при анализе составов химических субстанций, обнаружении нежелательных вещественных вкраплений, выявлении дефектов поверхностей и решении прочих подобных задач.

Кратко о методе флуоресцентной микроскопии

Метод основан на способности фоточувствительных молекул к структурной интеграции с микрообъектами. Они прикрепляются к образцам с помощью функциональных химических групп и при световом облучении возвращают часть поглощенных фотонов.

Исследователи принимают и анализируют интенсивность волновых сигналов, делая выводы о строении изучаемых объектов и протекающих в них процессах.

Какие процессы участвуют

При флуоресценции происходят поглощение квантов и их последующее частичное высвобождение. Электроны облучаемого флуорофора приобретают дополнительную энергию и на мгновение перемещаются на более высокий энергетический уровень.

При возвращении в первичное состояние происходит высвобождение фотонов во внешнюю среду. В этом процессе часть энергии тратится на восстановление термодинамического равновесия, поэтому величина испускаемой волны больше длины волны возбуждения. Разницу между энергиями возбуждающего и испускаемого излучений называют стоксовым сдвигом.

Формирование изображения

Микроскопы оснащены электронными модулями, позволяющими визуализировать исследуемые объекты при низких уровнях световых сигналов. Эти узлы содержат устройства с зарядовой связью, способные преобразовывать волновую энергию в фототок.

Далее электрические заряды сканируются регистрами сдвига и преобразуются в аналоговые, а затем в цифровые сигналы. На основе полученных данных формируется изображение высокого разрешения в 12- или 16-битном формате.

Ключом к качественной визуализации является правильный подбор оптических фильтров, гарантирующих надежное разделение испускаемого тусклого от возбуждающего яркого света.

Подробно о конструкции и принципе работы микроскопа

Устройство разработано на базе традиционного оптического микроскопа, но имеет иной принцип работы. Исследуемый образец помечают люминесцирующими веществами, а затем с помощью сложной системы фильтров собирают испускаемые фотоны и визуализируют микрообъекты.

Устройство микроскопа

В основном прибор обладает всеми модулями, характерными для оптических микроскопов. Однако он, в отличие от них, оснащен флуоресцентным модулем.

Задачами данного технологического узла являются направление возбуждающего излучения на образец и последующее отделение отраженного света от общего потока. Для этого используется сложная система фильтров, объединенных в единый блок.

Также особенностью флуоресцентного микроскопа является тип осветителя. Оптические устройства в качестве источника света используют лампы накаливания с непрерывным спектром и максимумом в красной зоне.

Такие приборы плохо подходят для возбуждения флуоресцирующих красителей, поглощающих излучение в коротковолновом диапазоне. Вместо них применяют галогенные или светодиодные лампы.

Конструкция фильтров-блоков

В основе конструкции микроскопа лежит блок, включающий набор следующих оптических элементов:

Фильтр возбуждения принимает излучение от источника света, пропуская длины волн заранее установленного диапазона. Дихроичное зеркало сначала отражает фотоны через оптический объектив на образец, а затем направляет флуоресценцию к системе обнаружения. Далее на пути испускаемого излучения стоит эмиссионный фильтр, который блокирует нежелательные волны.

При установке фильтров важно обеспечить правильный угол наклона и ориентацию относительно светового пути, чтобы эффективно управлять фотонным потоком.

Производители помечают в основном белой точкой отражающую сторону дихроичного зеркала, а на остальных деталях указывают направляющие стрелки.

Используемые осветители

В качестве источников света люминесцентные микроскопы чаще используют галогенные лампы. Они имеют небольшие размеры, хорошую цветопередачу и невысокую стоимость. Однако из-за низкой яркости и малого срока службы эти устройства постепенно вытесняются светодиодными LED-элементами.

Источники света на основе LED-технологии считаются самыми востребованными в современной микроскопии. Это универсальные полупроводниковые осветители, обладающие широким набором спектральных характеристик. Они позволяют использовать излучение в диапазоне от ультрафиолетовой до ближней инфракрасной зоны.

Ранее в люминесцентной микроскопии широко применялись ртутные лампы высокого давления. Их использование запрещено российским законодательством с 2020 г.

Это надежные и непрерывно работающие установки, обладающие наиболее высокими значениями яркости по сравнению галогенными и светодиодными приборами.

Однако они имеют ряд существенных недостатков: малый срок службы, изменение спектральной характеристики с возрастом и продолжительные интервалы между выключением и включением.

Флуоресцентные камеры

Камера считается одним из важнейших и самых дорогих компонентов микроскопа. Она должна обладать высокой чувствительностью и низким уровнем шума, чтобы захватить как можно больше фотонов.

Для флуоресцентной визуализации предпочтительно монохромное устройство, которое обеспечивает одинаковое обнаружение сигналов на всех пикселях и увеличивает общую чувствительность.

Камера оснащается 1 из 2 типов матриц: прибором с зарядовой связью (CCD) или устройством на металл-оксид-полупроводниковых транзисторах (sCMOS).

Они преобразуют волновые сигналы в электрические заряды, которые поступают на усилитель, а затем передаются в аналогово-цифровой преобразователь.

В CCD-камерах все сигналы сканируются одновременно, что позволяет снизить уровень шума и повысить чувствительность. В sCMOS-устройствах считывание происходит произвольно, вследствие чего возникают нежелательные вибрации, искажается геометрия объектов при визуализации.

Выбор камеры зависит от типа исследуемых образцов, требуемой частоты кадров, угла обзора, разрешения и чувствительности. Например, для промышленных изысканий необходимы высокое качество изображений и скорость работы, а для медико-биологических исследований важнее чувствительность устройства.

Обозначения для фильтров

Производители разрабатывают собственные системы кодов для обозначения фильтров, используемых во флуоресцентной микроскопии, что нередко приводит к путанице в терминологии. Кодировка в основном отражает вещественный состав изделия или его функциональные свойства.

При маркировке фильтров возбуждения часто используют аббревиатуры UG и BG, обозначающие ультрафиолетовое и синее стекла соответственно.

Современные фильтры высокого разрешения с интерференционной оптикой многими производителями кодируются сокращением IF. На узкополосных моделях встречаются символы KP или SP.

Дихроичные светоделители маркируются следующими акронимами: DM — дихроичное зеркало, CBS — хроматический светоделитель, TK — щелевой делитель, FT — делитель цвета, RKP — узкополосный отражатель. Все эти обозначения взаимозаменяемы.

Эмиссионные фильтры кодируются следующими символами: L или LP — широкополосный элемент, GG или Y — желтое стекло, OG или O — оранжевое стекло, RG или R — красное стекло, BA — запирающее стекло, K — щелевой фильтр.

Иногда наряду с акронимом присутствует числовое значение, указывающее на длину волны в нанометрах, на которой фильтр достигает половины величины максимальной пропускной способности.

Скорость обесцвечивания образцов

При исследовании микропрепаратов важно учитывать скорость процесса фотообесцвечивания — необратимого распада фоточувствительных молекул вследствие окисления их кислородом под воздействием светового потока высокой интенсивности.

Фотообесцвечивание неминуемо, но его скорость зависит от реакционной способности и окружения флуорофоров.

Для замедления процесса исследователи используют:

Кроме того, необходимо снижать интенсивность светового излучения и сокращать продолжительность волнового воздействия.

Иногда образец содержит собственные молекулы или органеллы, способные к люминесценции. Нередко они испускают волны той же длины, что и искусственно внедренные флуорофоры.

При визуализации сложно различать ожидаемые и эндогенные сигналы. В этом случае фотообесцвечивание может оказаться полезным. Образец подвергают длительному воздействию ультрафиолета для разрушения его собственных фоточувствительных компонентов. Затем в структуру изучаемого объекта внедряют флуоресцентные белки, с помощью которых осуществляют визуализацию.

Источник

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *